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蛋白浓度测定的方法具体有哪些?

蛋白浓度测定的方法具体有哪些?

发布时间:2019-10-08

蛋白质浓度测定是利用化学或物理方法测定蛋白质浓度,一般蛋白浓度测定的方法有很多种,每种方法都有优点和局限性,下面我们就具体看一下蛋白浓度测定的方法都有哪些。

蛋白浓度测定的方法:

1. 紫外分光光度法

紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是讲蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法,不需要任何试剂,操作简单且易回收。蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收,这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的,所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差,其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度,通过计算可得较为正确的蛋白质含量。

2. 双缩脲法

利用半饱和硫酸铵或27.8%硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来,而此时血清白蛋白仍处于溶解状态,因此可把两者分开,这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学,而且还广泛地用于生物化学研究工作中,如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。

蛋白质和双缩脲一样,在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物(双缩脲反应),且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比,因此可于蛋白质的定量测定。

但必须注意,此反应并非蛋白质所特有,凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物,双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8%硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清,取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量,剩余部分则用滤纸过滤,使析出的球蛋白与白蛋白分离,取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白/球比值。

3. Folin-酚试剂法

目前实验室较多用Folin-酚法测定蛋白质含量,此法的特点是灵敏度高,较双缩脲高两个数量级,较紫外法略高,操作稍微麻烦,反应约在15分钟有最大显色,并最少可稳定几个小时,其不足之处是干扰因素较多,有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。其原理是蛋白质中含有酚基的酪氨酸,可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物,颜色深浅与蛋白含量成正比。

4. 考马氏亮蓝G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高,可检测到微量蛋白,操作简便、快迅,试剂配制极简单,重复性好,但干扰因素多。考马氏亮蓝G-250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色,当它通过疏水作用与蛋白质结合后,变成蓝色,最大吸收波长从465nm转移到595nm处,在一定的范围内,蛋白质含量与 595nm的吸光度成正比,测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

以上便是实验室中常见的几种蛋白浓度测定的方法,另外还有凯氏定氮法和BCA法,有凯氏定氮法结果最精确,但操作复杂,BCA法又以其试剂稳定,抗干扰能力较强,结果稳定,灵敏度高而受到欢迎。



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