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重组人蛋白细胞因子的研究选择-细胞因子

重组人蛋白细胞因子的研究选择-细胞因子

发布时间:2019-08-22

1.重组蛋白表达体系
       MCE 重组蛋白表达体系主要有:大肠杆菌,酵母细胞,昆虫细胞和哺乳动物细胞。
 
2.重组蛋白纯度和浓度测定
重组蛋白纯度测定方法:a。 SDS-PAGE 测定法;b。 HPLC 测定法;c。 银染测定法。
重组蛋白浓度测定方法:a. Bradford 蛋白定量测定法;b. BCA 蛋白定量测定法;c. SDS-PAGE 蛋白定量测定法。
 
3.重组蛋白表达体系对比
    

表达体系优缺点
原核体系繁殖快、成本低,产量高,但不能进行糖基化修饰,常为包涵体
哺乳动物细胞结构与天然蛋白最接近,完善的翻译后加工,活性更好,但表达水平较低,周期长,技术要求高
酵母细胞易操作,蛋白背景弱,适合大规模生产,便于纯化,但存在产量不高以及糖基化达不到要求等问题
昆虫细胞功能与天然蛋白相似,对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势,但糖基化程度低,形式比较单一,活性不如哺乳动物细胞表达系统

 
 
4.重组蛋白表达体系选择
 

研究目的蛋白要求最适表达系统
用作抗原,获得特异性抗体纯度>80%,不需要蛋白修饰或天然活性,可带标签原核表达体系
用于检测蛋白质结晶及晶体结构研究纯度>95%,浓度通常在 10 mg/mL2/3 是原核表达体系,1/3 是昆虫细胞表达体系与哺乳动物细胞表达体系
蛋白的功能研究需要保存蛋白的天然活性原核表达体系和真核表达体系
用于药物研究的蛋白质一般要求尽量保存天然序列,具有天然活性真核表达体系

 
5.重组蛋白开盖使用前处理
 
为防止冻干粉产品的粉末沾在管壁或管盖上,使用前请勿开盖,离心(约13000 rpm)处理 20-30 秒,使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。MCE 保证每管产品的蛋白总量达到标示含量。
 
6.重组蛋白复溶
 
a。 使用前先离心(约 13000 rpm)处理 20-30 秒,使附于管盖或管壁的蛋白收集于管底。
b. 严格依据说明书,使用推荐的溶液将蛋白冻干粉溶解至推荐的浓度。大多数重组蛋白建议溶解在灭菌超纯水中,浓度不低于 100 μg/mL,以便于后续进一步稀释至工作浓度。
c。 用移液枪轻吹混匀,或将管盖盖好后轻柔颠倒数次进行混匀,低速离心数秒。
d。 复溶后的重组蛋白在室温放置数分钟,以保证蛋白能够充分溶解。
 
7.重组蛋白储存
 
由于每次冻融都会造成蛋白的部分变性,因此建议客户收到产品后适量分装避免反复冻融。
a. 短期储存:
冻干粉状态产品在室温下存放 3 周,不影响活性。复溶后的产品在 4℃ 可稳定储存 1-2 周。
b. 长期储存:
冻干粉状态产品在 -20℃ 下,可稳定保存至少一年;推荐 -80℃ 长期保存,以获得更稳定性能的产品。可选择包含一定浓度载体蛋白(0.1% BSA, 5% HSA, 10% FBS,或 5% 海藻糖)的溶液或培养基复溶产品,分装后冻存于 -20℃ 下,可保存至少三个月;推荐 -80℃ 长期保存,以获得更稳定性能的产品。
注:分装冻存时,蛋白浓度不低于 100 ng/μL,且每管的体积不可小于 20μL。
 
8.重组蛋白标签影响
 
蛋白标签指重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽。MCE的重组蛋白产品大部分为无标签状态,但少数重组蛋白产品因为不同目的需要加有标签。
a。 标签利于蛋白纯化。
b. 当目的蛋白无特定抗体直接鉴定,可利用标签进行 Western Blot 或ELISA 分析方法鉴定。
c. Fc 标签可以提升重组蛋白的半衰期以提高分子的稳定性,同时也能够促进重组蛋白形成活性二聚体。重组蛋白标签对蛋白的生物学活性影响存在未知结论,但对大部分检测应用中,重组蛋白的标签对蛋白本身生物学活性并无影响,所以无需移除。MCE 对重组蛋白产品都已经做过生物学活性检测并将数据公示于 COA 中。
 
9. 重组蛋白活力值与计算方法
 
MCE 重组蛋白的生物学活性 (ED50) 测定数据在 COA 中可以获得。ED50 是Effective Dose 50 的缩写,是可诱导 50% 最大反应的蛋白浓度 (ng/mL)。


计算公式如下:
MCE 的重组蛋白产品并未采用 WHO (National Institute for BiologicalStandards and Control) 设定的标准来测定活力值,以上计算公式并不适用于“International Units”和“ED50”的转换关系,需要采用国际标准品对比相同实验获得该重组蛋白的 IU 值。
 
10. 重组蛋白 ED50 值的批间差
 
不同批次的产品或不同实验方法的测定都会导致重组蛋白产品的 ED50 值变化,我们推荐客户根据自己的实验测定得到最合适的实际 ED50 值。
 
11. 重组蛋白应用方案
 
MCE 重组蛋白产品的 COA 中显示的实验方案只是确认该产品的 ED50 值,但并不与终端客户的不同类型实验结果存在等效性。如果客户需要应用在不同于本公司产品测试的实验方法时,我们建议客户通过实际测试获得最佳 ED50 值。
 
12.重组蛋白的种属交叉活性
 
重组蛋白的种属交叉活性需要根据具体产品而定;建议尽量选择对应种属的重组蛋白。如实在无法匹配种属,以下信息供参考:
a. 大多数人细胞因子对小鼠细胞有效 (仅少数例外)。
b。 多数小鼠细胞因子对人细胞有效,但特异性可能不强。如小鼠的表皮生长因子(EGF)对人的表皮细胞有活性,对人的其他种类细胞可能也有作用。
c。 干扰素、GM-CSF、IL-3、IL-4 具有种属特异性,即重组人的这些细胞因子只能作用于人细胞,对小鼠和大鼠等其他种而重组小鼠的这些细胞因子也仅用于小鼠,对人的细胞无效。
d. 成纤维细胞生长因子 (FGFs)、神经营养素 ( Neurotrophins,如 BDNGF、GDNF、CNTF、β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守,各种属间交叉活性强。



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